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逆轉錄(RT)實驗要素分析

日期:2023-08-13 14:18
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摘要: 逆轉錄(reverse transcription)是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程,即 RNA 指導下的 DNA 合成,逆轉錄實驗包括3大要素,分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板: 1. 引物:逆轉錄引物主要有3種,包括 Oligo(dT)、Random Primers 和基因特異性引物(GSP)。其中 Oligo(dT)具有12-20個 T 堿基,并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對,可合成全長的 cDNA,但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ,對模板質量要求高,較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基,可隨機識別模板并結合,適合復雜結構和微量模板,但特異性低,小片...

  逆轉錄(reverse transcription)是以 RNA 為模板合成 DNA 的過程,即 RNA 指導下的 DNA 合成,逆轉錄實驗包括3大要素,分別是引物、逆轉錄酶和 RNA 模板:

1. 引物:逆轉錄引物主要有3種,包括 Oligo(dT)、Random Primers 和基因特異性引物(GSP)。其中 Oligo(dT)具有12-20個 T 堿基,并且與真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配對,可合成全長的 cDNA,但僅擴增有 polyA 尾的 mRNA ,對模板質量要求高,較適合克隆實驗。而 Random Primers 具有6-9個堿基,可隨機識別模板并結合,適合復雜結構和微量模板,但特異性低,小片段多,適合后續 qPCR 實驗?;蛱禺愋砸锟梢宰R別特定模板序列,具有特異性強,靈敏度高的特點,但需合成特定的序列。所以根據不同實驗需求可進行相應引物的選擇。


2. 逆轉錄酶:一種是來自純化的禽成髓細胞瘤病毒(AMV),由兩條肽鏈組成,具有聚合酶活性和很強的 RNaseH 活性,它zui 適溫度是42℃,zui適 pH8.3,在高反應溫度時可消除 mRNA 的二級結構對逆轉錄的阻礙,然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 產生也限制其長度。另一種來源于鼠白血病病毒(M-MLV),是單肽鏈的,有 RNA 聚合酶活性和相對較弱的 RNaseH 活性,zui適溫度37℃,zui適 pH7.6,較弱的  RNaseH 活性對獲得2-3kb的 mRNA 的全長 cDNA 有很大好處。


3. RNA 模板:通常利用紫外分光光度計檢測純度,要求A260/280=1.9~2.1,A260/230=2.0~2.2。利用瓊脂糖凝膠電泳檢測 RNA 的完整度,完整的總 RNA 在進行瓊脂糖凝膠電泳時會產生清晰的28S 和18S rRNA 條帶(真核樣品),28S rRNA  條帶的強度應當大致為18S rRNA 條帶的兩倍,并且無 gDNA 和蛋白殘留。

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