PCR引物退火溫度詳解

日期:2024-04-15 16:04
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摘要:PCR引物退火溫度詳解

  引物的另一個重要參數是熔解溫度(Tm)。這是當50%的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。  

  設定Tm有幾種公式。高鹽溶液中的雜交,適用于小于18堿基的引物。根據GC含量估算Tm。確定引物Tm zui 可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列1級結構和相鄰堿基的特性預測引物的雜交穩定性。大部分計算機程序使用近鄰分析法。


根據所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值,所有退火溫度只是一個起始點??梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得zui佳結果,兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃,就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設定為比zui低的Tm低5℃?;蛘邽榱颂岣咛禺愋?,可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環,然后在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩余的循環。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

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